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组织研磨仪在猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测样品方法中的应用
发布时间:2018-11-30   点击次数:663次

猪瘟检测,主要监测手段是实时荧光定量PCR,大致流程步骤为:样品研磨(制备样品)----磁珠提取(提取DNA,RNA)----结合专用试剂盒上实时荧光定量PCR仪检测。而在样品研磨过程中采用新锐精仪组织研磨仪GD200GD300GD16都可以很好运用到这一环节中来,下面以GD16为例:

 

1 器材和设备

1.1组织研磨仪GD16

1.2离心管

1.3 高速台式冷冻离心机:大离心力12000g以上

1.4冰箱

1.5 荧光PCR检测仪

1.6 微量移液器和吸头

 

2 样品的采集

2.1采样注意事项

采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样本不得交叉污染。

2.2采样工具

扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样抢。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡5Min~10Min,经清水冲洗。

灭菌牙签和0.5ml1.5ml离心管经(121±2)℃,高压灭菌15Min;剪、镊经160℃干烤2h

2.3 采样方法

2.3.1 活体样品

固定活猪的上唇,用开口器打开口腔,用采样抢采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至0.5ml1.5ml离心管并作标记,编号送实验室。取待检样品,按1:5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。

2.3.2 内脏样品

采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室。取50mg~100mg待检样品,按1:5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。

2.3.3  4%EDTA抗凝血

用无菌注射器直接全血,注入含1/10 4%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用。

2.3.4 排泄物

挑取少许粪便样本于离心管中,加入适量生理盐水,振荡混匀,室温3000g,离心管15min,取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。

2.3.5 细胞培养物

细胞培养物冻融3次,转入离心管中编号备用。

2.3.6 存放与运送

采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置-70℃冰箱,但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,在6h~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

 

3.实时荧光RT-PCR检测

 

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